MOLECULAIR BIOLOGISCH ONDERZOEK
De moleculaire diagnostiek van infectieziekten onderzoekt de aanwezigheid en eigenschappen van ziekteverwekkende micro-organismen op basis van DNA- en/of RNA-structuren. Hiermee is het mogelijk om bacteriën, virussen, schimmels en parasieten te onderzoeken zonder dat deze gekweekt hoeven te worden. Een belangrijk voordeel is dat daarmee deze onderzoeken veel specifieker zijn, en tevens (vaak) gevoeliger zijn. Hoe werken deze moleculaire technieken?
Technieken
De meest bekende moleculaire test is de polymerase-ketting reactie, ook wel de PCR genoemd. Hierbij wordt m.b.v. specifieke stukjes DNA (primers) het gewenste stuk DNA of RNA geamplificeerd en met behulp van een detectiemethode dat specifieke stuk aangetoond of zichtbaar gemaakt.
Hiervoor dient DNA of RNA eerst vrijgemaakt te worden uit de cel of viruspartikel en te worden gezuiverd van de stoffen in het patiëntmateriaal die de PCR-reactie kunnen verstoren. Het product wat zo zuiver mogelijk DNA en RNA bevat is daarna geschikt voor PCR of een andere moleculaire techniek.
Real-time PCR
Een “real-time” PCR maakt gebruik van fluorescerende probes om de vermenigvuldigde stukken DNA aantoonbaar te maken. Die vermenigvuldiging verloopt door middel van een aantal cycli van temperatuurwisselingen waarbij bij elke cyclus de hoeveelheid specifiek DNA wordt vertweevoudigd. Uiteindelijk is dit zo veel dat het aantoonbaar gemaakt kan worden m.b.v. zo’n fluorescente probe.
Varianten op de Real-time PCR
Bij een “conventionele” PCR wordt doorgaans een gelectroforese techniek gebruikt met een kleurstof om deze geamplificeerde stukken zichtbaar te maken. Ook kunnen probes gebruikt worden die aan fluorescente bolletjes of een membraan gekoppeld zijn (
FISH). Varianten op de “real-time” PCR zijn de Nicking enzyme amplification reaction (
NEAR) en de Loop-mediated isothermal amplification (
LAMP) die gebruikt worden in bijv. de ID-Now®-analyzer voor snelle influenza/RSV of SARS-CoV-2 detectie en de Alethia®-analyzer voor malaria-diagnostiek. Deze twee varianten hebben als voordeel dat de reactie bij één temperatuur verloopt en veelal veel sneller is dan de real-time PCR of conventionele PCR. Nadeel is dat er (meestal) geen kwantitatieve maat aan gehangen kan worden.
Daarnaast is het mogelijk om met behulp van transcriptie het RNA te vermenigvuldigen tot DNA en dit vervolgens aantoonbaar te maken. Deze techniek wordt TMA (transcription-mediated amplification) genoemd. Deze techniek is eveneens relatief snel. Wel is hierbij ook het nadeel dat kwantificering niet mogelijk is door de isotherme transcriptie-reactie. Bij Comicro wordt deze techniek gebruikt voor de SOA-bepalingen.
Naast amplificatie-technieken wordt ook steeds vaker een sequencing techniek gebruikt om niet alleen de aanwezigheid van een stuk DNA of RNA aan te tonen, maar tevens de precieze volgorde van de nucleotiden of basen te bepalen in dat geamplificeerde stuk. Dit wordt o.a. gedaan voor het bepalen van virale resistentie tegen HIV en voor het bepalen van het genotype van HCV en HBV. Het is ook mogelijk om de DNA- of RNA-volgorde van het hele genoom van een bacterie, schimmel, parasiet of virus te bepalen. Dit wordt m.b.v. whole-genome sequencing (WGS) gedaan. Momenteel wordt dit uitgevoerd door collega’s van OLVG lab.
Bepalingen
Comicro beschikt over verschillende (combinaties van) analyzers om moleculaire bepalingen uit te voeren. Afhankelijk van de beschikbaarheid en de indicatie wordt een keuze gemaakt uit een van de analyzers. De bepalingen die bij Comicro m.b.v. moleculaire technieken worden uitgevoerd staan weergegeven in de tabel onderaan deze pagina.
Van meetresultaat naar consult
De moleculaire testen genereren aanvankelijk een meetsignaal in de analyzer. Dat kan bijvoorbeeld een lichtflitsje zijn (fluorescentie) of een neerslagreactie waardoor een lichtbron gedempt wordt. Dit meetsignaal, vaak in combinatie met een tijdsafhankelijke waarde bepaalt of het aan te tonen target of micro-organisme aanwezig is of niet. Elke bepaling heeft zo zijn gevoeligheid en specificiteit. Idealiter is de gevoeligheid 1 cel of 1 DNA- of RNA-kopie per reactie en toont deze uitsluitend het target of micro-organisme aan waarvoor de bepaling bedoeld is. Die informatie neemt de medisch moleculair microbioloog mee in de interpretatie van een resultaatwaarde: positief/negatief evt. met een gekwantificeerde maat zoals het aantal virusdeeltjes/mL. Tevens wordt bij een aantal testen een semi-kwantitatieve meetwaarde gegenereerd: de Ct-waarde. Deze waarde geeft een relatieve indicatie van de hoeveelheid van het aan te tonen target. Een laag getal duidt op veel target, een hoog getal duidt op een kleine hoeveelheid van het target.
Dit getal is een goede maat om de kwaliteit van de bepaling te monitoren aan de hand van vastgestelde standaarden. Het laboratorium beschikt over verschillende controles om die kwaliteit te bepalen zodat de juiste specificiteit en sensitiviteit gegarandeerd kan worden, en fout-positiviteit of fout-negativiteit voorkomen wordt.
De aanwezigheid en eventueel de relatieve hoeveelheid van het target kan een goede indicatie zijn voor een antimicrobiële behandeling van de infectie van de patiënt. De arts-microbioloog kiest aan de hand van deze gegevens en de klinische gegevens van de patiënt de best mogelijke behandeling en adviseert deze aan de behandelend arts. Soms is er haast bij een juiste keuze van behandeling waar zgn. sneltesten erg geschikt voor zijn. Dit zijn testen die op stuks basis verwerkt worden in speciaal daarvoor ontworpen cassettes en analyzers. Deze testen zijn doorgaans wel duurder in gebruik en lenen zich niet goed voor grote aantallen patiëntenmonsters. Wanneer de infectie minder ernstig is, of deze is al langer aanwezig zoals bij chronische infecties, is er minder haast in het vaststellen van de diagnose en kan volstaan worden met een bepaling die in batches éénmaal per dag wordt uitgevoerd. Op deze wijze wordt aan de hand van de vraagstelling de meest optimale en efficiënte diagnostische zorg geleverd.
Tabel 1: Overzicht moleculaire bepalingen Comicro (januari 2026)
|
Bepaling (micro-organisme of ‘target’)
|
Techniek
|
Analyzer
|
|
MRSA/Staphylococcus aureus
|
Real-time PCR
|
GeneXpert
|
|
VRE (vancomycine resistente enterokokken) voor buitenlandscreening/opname resp. ringonderzoek
|
Real-time PCR
|
GeneXpert/LightCycler 480II
|
|
Clostridium difficile + toxine
|
Real-time PCR
|
GeneXpert/Qiastat-DX
|
|
Carbapenemase-genen (KPC, VIM, Oxa-48, NDM)
|
Real-time PCR
|
GeneXpert
|
|
Norovirus
|
Real-time PCR
|
GeneXpert/Qiastat-DX/Ingenius
|
|
Influenza A / B
|
Real-time PCR
|
GeneXpert/Qiastat-DX
|
|
Respiratoir syncytieel virus
|
Real-time PCR
|
GeneXpert/Qiastat-DX
|
|
SARS-CoV-2
|
Real-time PCR
|
GeneXpert/Qiastat-DX/LightCycler 480II
|
|
Chlamydia trachomatis
|
TMA
|
Hologic Panther
|
|
Neisseria gonorrhoeae
|
TMA
|
Hologic Panther
|
|
Mycoplasma genitalium
|
TMA
|
Hologic Panther
|
|
Trichomonas vaginalis
|
TMA
|
Hologic Panther
|
|
Helicobacter pylori + clarithromycine resistentie
|
Real-Time PCR
|
Ingenius
|
|
Salmonella species
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II
|
|
Shigella species
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II
|
|
Yersinia enterocolitica
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II
|
|
Campylobacter species
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II/Qiastat-DX
|
|
Giardia lamblia
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II/Qiastat-DX
|
|
Cryptosporidium parvum
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II/Qiastat-DX
|
|
Entamoeba histolytica
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II/Qiastat-DX
|
|
Dientamoeba fragilis
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II
|
|
E. coli ETEC
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II/Qiastat-DX
|
|
E. coli EIEC
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II/Qiastat-DX
|
|
E. coli STEC (stx1/stx2)
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II/Qiastat-DX
|
|
E. coli EAEC
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Aeromonas urinae
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II
|
|
Plesiomonas shigelloides.
|
Real-time PCR
|
LightCycler 480II/Qiastat-DX
|
|
Escherichia coli type K1
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Adenovirus genotype F40/41
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX/Ingenius
|
|
Rotavirus
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX/Ingenius
|
|
Sapovirus genotypen I t/m IV
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX/Ingenius
|
|
Astrovirus
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX/Ingenius
|
|
Haemophilus influenzae
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Listeria monocytogenes
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Neisseria meningitidis
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Streptococcus agalactiae
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Streptococcus pneumoniae
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Bordetella pertussis
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Streptococcus pyogenes
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Mycoplasma pneumoniae
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Chlamydia pneumoniae
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Humaan herpesvirus 6
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Humaan parechovirus
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Varicella zoster virus
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Enterovirus
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Herpes simplex virus 1
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Herpes simplex virus 2
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Adenovirus
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Coronavirus 229E, HKU1, NL63 en OC43
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Bocavirus
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Human metapneumovirus
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Humaan rhinovirus/enterovirus
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Legionella pneumophila
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Parainfluenzavirus 1 t/m 4
|
Real-time PCR
|
Qiastat-DX
|
|
Mycobacterium tuberculosis / rifampicine resistentie
|
Real-time PCR
|
GeneXpert
|
|
Malaria spp.
|
LAMP
|
Alethia
|
Auteur: Wil van der Reijden, medisch moleculair microbioloog